Il progetto A deve produrre:

• il file gtf con tutte le regioni introniche
• il file di output collassato sulle regioni introniche

Il progetto B deve produrre:

• N file gtf degli N geni passati dall'utente che presentano regioni introniche (se il gene non presenta regioni introniche non viene stampato il file gtf)
• il file di output (unico) collassato sulle regioni introniche dei geni che sono stati passati dall'utente

Funzionalità aggiuntive:

• produzione degli output considerando gli introni filtrati, ossia eliminando dalle regioni introniche quelle parti che in altri trascritti costituiscono regioni esoniche (come falsi positivi)
• solo per progetto B: possibilità di stampare il file BedGraph relativo al gene inserito dall'utente (qualora questo abbia regioni introniche perchè il problema è intron retention)

• Verifica di aver ottenuto il formato dei file in modo corretto
• Verifica di aver calcolato correttamente le regioni introniche (metodo grafico mappatura introni esoni per lo stesso trascritto)
• Verifica di aver effettuato in maniera corretta il filtraggio degli introni (metodo grafico..)
• Verifica di aver ottenuto il file di output solo per introni che hanno un numero di reads diverso da 0 e che il file sia ottenuto in maniera coerente con i file precedenti

Il problema affrontato nei progetti è quello di andare a valutare la presenza dell'intron retention relativo ai geni contenuti nel file di annotazione fornito (Homo_sapiens.GRCh.37.60.chr.gtf).

Il progetto A si occupa di fornire il file di output che contiene le informazioni relative al quantitativo di reads che vengono mappate sui singoli introni nei vari geni per l'intero file di annotazione fornito.

Il progetto B si occupa di fornire il file di output nello stesso formato del progetto A ma solo per i geni che l'utente vuole analizzare. Inoltre, con il file in formato bedGraph per i vari geni, è possibile visualizzare su genome Browser la mappatura delle reads.

Il problema che si può presentare è la presenza di falsi positivi: quando un introne in un altro trascritto è un esone (totalmente o in parte) un quantitativo alto di reads potrebbe non essere associato al fenomeno di intron retention. Per questo motivo è utile produrre la stessa tipologia di file di output filtrando gli introni nei vari trascritti dello stesso gene. In questo modo le regioni introniche rimanenti sono tali per tutti i trascritti e, qualora si verificasse, sarebbe oppurtuno parlare di intron retention.

Passi per un'esecuzione corretta del programma:

• Lancia il programmma nominato 'pbiMain.py' da terminale, comparirà una schermata che richiede l'inserimento del nome del file di annotazione e del file di allineamento da utilizzare.
• Inserisci il nome dei file richiesti, comparirà una schermata per procedere con la scelta del progetto (A o B)o uscire dall'applicativo.
• Inserisci la lettera corrispondente all'opzione da eseguire.
• Se la scelta è di eseguire uno dei due progetti comparirà il relativo menù di scelta per ottenere gli output desiderati. Se hai inserito una lettera non valida comparirà un opportuno messaggio di errore e la precedente schermata per procedere.

Scelta di procedere con il progetto A:

• Scegli una delle opzioni riportate nel menù del progetto A per proseguire, 'c' per cambiare progetto oppure 'e' per uscire.

• Se la scelta non è valida comparirà un apposito messaggio di errore e la schermata iniziale di 'scegli progetto' per procedere. Se la scelta è valida comparirà una schermata che riporta l'esecuzione corrente, indicando i passi che si stanno svolgendo e i file di output creati. In particolare, se la scelta è:

  • 1. Esegui il progetto A con tutti gli introni,
       il programma crea un file 'pA_introni.gtf' per tutte le regioni introniche ricavate dal file di annotazione fornito considerando
       solo le righe dove compare 'exon' che verrà utilizzato per eseguire l'allineamento delle reads. Da quest'ultimo processo viene stampato un file 'pA_reads_mapped.txt' che contiene le informazioni delle reads mappate sulle varie regioni introniche. Il programma procede con la stampa del file 'pA_output.txt' contenete le informazioni della mappatura collassate per introni: ogni introne è associato ad un gene e ad un cromosoma e ad ogni introne possono essere associati più trascritti.
  • 2. Esegui il progetto A con gli introni filtrati, il programma crea un file 'pA_introniFiltrati.gtf' per le regioni introniche filtrate ricavate dal file di annotazione fornito considerando solo le regioni dove compare 'exon' che verrà utilizzato per eseguire l'allineamento delle reads. Da quest'ultimo processo viene stampato il file 'pA_reads_mapped_filtrati.txt' che contiene le informazioni delle reads mappate sulle varie regioni introniche filtrate. Il programma procede con la stampa del file 'pA_outputFiltrato.txt' contenente le informazioni della mappatura collassate per introni filtrati: ogni introne è associato ad un gene e ad un cromosoma e ad ogni introne possono essere associati più trascritti.

  Alla fine dell'esecuzione del programma comparirà la schermata iniziale della scelta del progetto.

Scelta di procedere con il progetto B:

• Scegli una delle opzioni riportate nel menù del progetto B per proseguire, 'c' per cambiare progetto oppure 'e' per uscire.
• Se la scelta non è valida comparirà un apposito messaggio di errore e la schermata iniziale di 'scegli progetto' per procedere. Se la scelta è valida comparirà una schermata che richiede di inserire il nome dei geni da analizzare.
• Inserisci il nome dei geni (differenziando tra lettere maiuscole e minuscole) separati da uno spazio. Comparirà una schermata che riporta l'esecuzione corrente, indicando i passi che si stanno svolgendo e i file di output creati. Se il gene inserito non contiene regioni introniche verrà stampato un messaggio per indicare l'accaduto e quel gene viene escluso dalla lista dei geni da elaborare. In particolare, se la scelta è:
  • 1. Esegui il progetto B con tutti gli introni, dopo aver inserito il nome dei geni da analizzare verranno create N cartelle, tante quanti sono i geni passati da linea di comando che effettivamente presentano regioni introniche. Nelle varie cartelle, per ogni gene da analizzare, verrà creato un file 'pB_introni.gtf' per le regioni introniche ricavate dal file di annotazione fornito considerando solo le regioni dove compare 'exon'. Nella cartella principale verrà creato un unico file 'pB_introni.gtf' che contiene le regioni introniche trovate per ciascun gene e che verrà utilizzato per eseguire l'allineamento sulle stesse. Nella cartella principale verrà stampato l'output ottenuto con l'allineamento 'reads_mapped.txt'. Il programma procede con la stampa del file 'pB_output.txt' contenente le informazioni della mappatura collassate per introni : ogni introne è associato ad un gene e ad un cromosoma e ad ogni introne possono essere associati più trascritti.
  • 2. Esegui il progetto B con gli introni filtrati dopo aver inserito il nome dei geni da analizzare verranno create N cartelle, tante quanti sono i geni passati da linea di comando che effettivamente presentano regioni introniche. Nelle varie cartelle, per ogni gene da analizzare, verrà creato un file 'pB_introniFiltrati.gtf' per le regioni introniche filtrate ricavate dal file di annotazione fornito considerando solo le regioni dove compare 'exon'. Nella cartella principale verrà creato un unico file 'pB_introniFiltrati.gtf' che contiene le regioni introniche trovate per ciascun gene e che verrà utilizzato per eseguire l'allineamento sulle stesse. Nella cartella principale verrà stampato l'output ottenuto con l'allineamento 'reads_mapped_filtrati.txt'. Il programma procede con la stampa del file 'pB_outputFiltrati.txt' contenente le informazioni della mappatura collassate per introni : ogni introne è associato ad un gene e ad un cromosoma e ad ogni introne possono essere associati più trascritti.
  • 3. Scelta 1 + bedGraph, si esegue la scelta 1 e, in aggiunta, verranno stampati i file 'pB_InEs.gtf' per le regioni introniche ed esoniche per ogni gene nella cartella corrispondente al gene in esame e un unico file 'pB_introniFiltrati.gtf' nella cartella principale che verrà utilizzato per eseguire l'allineamento. Verrà stampato l'output dell'allineamento 'reas_mappedInEs.txt' e i file in formato BedGraph per ogni gene nelle rispettive cartelle dei geni ('nome_gene.bedGraph').
  • 4. Scelta 2 + bedGraph, si esegue la scelta 2 e, in aggiunta, verranno stampati i file 'pB_introniEsoni_filtrati.gtf' per le regioni introniche filtrate ed esoniche per ogni gene nella cartella corrispondente al gene in esame e un unico file 'pB_InESFiltrati.gtf' nella cartella principale che verrà utilizzato per eseguire l'allineamento. Verrà stampato l'output dell'allineamento 'reas_mappedInEs_filtrati.txt' e i file in formato BedGraph per ogni gene nelle rispettive cartelle dei geni ('nome_gene.bedGraph').

main()
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|----> inserisciFileDiAnn()
|----> inserisciFileDiAll()
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|----> menuProgetto()
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		|----> menuA()
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		|		|----> progettoA()
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		|				|----> pbiA.inizializzazione()
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		|				|		|----> filtraFileDiAnn()
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		|				|----> *filtraIntroni()
		|				|----> stampaGTF()
		|				|----> estraiReads()
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		|				|		|----> callBedtools()
		|				|
		|				|----> collapsed()
		|						|
		|						|----> caricaReads()
		|						|----> stampaOutput()
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		|----> menuB()
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				|---- progettoB()
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						|----> pbiB.inizializzazione()
						|		|
						|		|----> filtraFileDiAnn()
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						|----> *filtraIntroni()
						|----> stampaGTF()
						|----> estraiReads()
						|		|
						|		|----> callBedtools()
						|
						|----> collapsed()
						|		|
						|		|----> caricaReads()
						|		|----> stampaOutput()
						|
						|----> pbiB.unisciRegioni()
						|----> pbiB.stampaGTFEsIn()
						|----> estraiReads()
						|		|
						|		|----> callBedtools()
						|
						|----> pbiB.caricaReadsEsIn()
						|----> pbiB.stampaBedGraph()

* solamente se si lavora con gli introni filtrati.